|
Резистентность патогенных
микроорганизмов к антимикробным средствам – одна из наиболее серьёзных угроз
мирового здравоохранения. Для борьбы с этой угрозой всемирными организациями
ВОЗ, ВОЗЖ и ФАО принят подход «Единое здоровье», согласно которому необходим
контроль распространения устойчивости к антибиотикам не только среди
возбудителей инфекционных заболеваний человека, но также среди бактерий,
вызывающих зоонозные инфекции. Данная работа посвящена разработке ПЦР-методик
для выявления наиболее часто встречающихся у зоонозных бактерий генов
устойчивости, в том числе к критически важным для медицины антибиотикам:
цефалоспоринам, колистину, фторхинолонам, а также к пенициллинам,
тетрациклинам, амногликозидам, сульфаниламидам и триметоприму. Использование
разработанных методик возможно в рамках ветеринарного мониторинга
антибиотикорезистентности для анализа различных образцов, в том числе и без
предварительного выделения бактериальных изолятов.
Резистентность возбудителей
инфекционных заболеваний к антибиотикам является глобальной проблемой как
клинической, так и ветеринарной медицины. В процессе распространения антибиотикорезистентности
в окружающей среде играет важную роль общая совокупность в ней патогенных,
комменсальных и свободно живущих бактерий, бактериофагов и мобильных
генетических элементов, которая является резервуаром резистентности, так
называемым «резистомом».
Генетические факторы
антибиотикорезистентности бактерий, как правило, ассоциированы с мобильной
частью бактериального генома: плазмидами, транспозонами, интегронами, геномными
островками и др. Это приводит к возможности горизонтального переноса генов
резистентности между таксономически отдаленными микроорганизмами. Именно так
патогенные микроорганизмы могут получить гены устойчивости к антибиотикам из
резистома.
Координация усилий медицинских и
сельскохозяйственных контролирующих организаций является одним из ключевых
пунктов рекомендаций Всемирной организации здоровья животных (ВОЗЖ) и ВОЗ по
разработке национальных планов противодействия распространению антибиотикорезистентности.
Важным направлением как в клинической практике, так и в ветеринарии стал
системный мониторинг распространения антимикробной резистентности бактерий, в
т.ч. с помощью современных молекулярно-генетических методов. Для ветеринарного мониторинга
назрела необходимость разработки экспресс-методик выявления генов антибиотикорезистентности,
наиболее часто встречающихся у бактерий ветеринарного происхождения, поскольку
существующие на рынке отечественные тест-системы ориентированы на клинический
материал, а не на материал от животных.
Для выбора и анализа последовательностей
генов резистентности и внутреннего контроля были использованы базы данных NCBI
BARRGD, Arg-ANNOT, CARD и ResFinder, а также собственные данные. Подбор праймеров
и зондов производили на онлайн-ресурсе «PrimerQuest Tool» (IDT) [8], анализировали
не менее пяти набороволигонуклеотидов для выявления каждого целевого гена. Для
анализа множественного выравнивания последовательностей использовали программу
Ugene и алгоритм Clustal omega. Для выбора оптимальных параметров структурных характеристик
наборов праймеров использовали программы PCR Primer Stats и Oligo Analysis Tool,
оценивали оптимальную температуру отжига, возможность образования димеров и
«шпилек». Специфичность праймеров оценивали при помощи онлайн-ресурса
«Primer-Blast», расположенного на сайте NCBI. Оптимизированы условия
мультиплексных ПЦР для амплификации фрагментов целевых генов. Выделение ДНК
проводили сорбционным методом с использованием коммерческих наборов реагентов.
В ФГБУ «ВГНКИ» на текущий момент разработаны
молекулярно-генетические методики выявления наиболее часто встречающихся генов
резистентности, в том числе к критически важным для медицины антибиотикам:
цефалоспоринам (CTX-M-1, CTX-M-9), колистину (mcr-1), к фторхинолонам (qnrS,
qnrB), а также к пенициллинам (CMY), тетрациклинам (tetA, tetM, tetO),
амногликозидам (aadA), сульфаниламидам (sul1) и триметоприму (dfrA12).
Сущность методик заключается в применении
ПЦР в режиме реального времени с использованием TaqMan-подобных зондов для
детекции фрагментов целевых генов в мультиплексном формате. Методики
распространяются на пробы, полученные от животных (фекалии и др.), из объектов
окружающей среды (смывы с клеток, стен, оборудования, подстилка и др.), из
продовольственного сырья, пищевых продуктов, без этапа выделения бактериальных
изолятов, а также чистые бактериальные культуры, выделенные из этих проб.
Выбор генов-мишеней проводился на
основе анализа литературных данных о встречаемости генов в бактериях ветеринарного
и медицинского происхождения и базы данных Pathogen Detection NCBI, результатов
ветеринарного мониторинга антибиотикорезистености в РФ, в том числе данных
полногеномного секвенирования выделенных изолятов. Кроме того, при выборе
учитывалась локализация генов в составе мобильных генетических элементов.
По результатам проведенного
анализа в качестве мишеней были выбраны гены, наиболее часто встречающиеся в
образцах от животных, из окружающей среды животноводческих и птицеводческих
комплексов, продуктах питания:
− гены плазмидных β-лактамаз расширенного
спектра класса А из субкластеров СТХ-М-1 и СТХ-М-9, гидролизующих цефалоспорины
и обеспечивающих инактивацию антибиотиков;
− гены β-лактамаз класса С CMY,
гидролизующих пенициллины и обеспечивающих инактивацию антибиотиков;
− плазмидный ген mcr-1, который кодирует
фермент, модифицирующий липид А наружной мембраны грамотрицательных бактерий,
снижающий связывание колистина с клеточной стенкой;
− плазмид-ассоциированные гены
qnrS и qnrB, которые кодируют белки, связывающиеся с ДНК-гиразой или топоизомеразой
IV и препятствующие взаимодействию фторхинолонов с данным ферментом;
− гены tetM и tetO, кодирующие
белки, нарушающие связывание тетрациклинов с 23S рибосомальной РНК бактерий;
− ген tetA, который кодирует
трансмембраннный белок, осуществляющий выведение тетрациклинов из клетки путем активного
транспорта;
− генов группы aadA, кодирующих
О-аденилтрансферазы, модифицирующие аминогликозиды путем присоединения
нуклеотида аденина;
− гены sul1 и dfrA12, кодирущие
атипичные ферменты пути биосинтеза фолатов дигидроптероатсинтетазу и дигидрофолатредуктазу,
соответственно, практически не чувствительные к сульфаниламидам и триметоприму.
В разрабатываемых методиках
выявления генов резистентности в качестве дополнительного внутреннего контроля
предусматривается выявление ДНК бактерий E. coli, Salmonella enterica, родов
Enterococcus, Campylobacter, часто представленных в смешанных метагеномных
образцах ДНК. Кроме того, данные микроорганизмы входит в состав обязательной панели
ветеринарного мониторинга антибиотикорезистентности. Выявление этих бактерий
поможет сравнивать данные, полученные микробиологическими и
молекулярно-биологическими методами. Система детекции для внутреннего контроля
не должна быть строго специфичной по отношению к указанному микроорганизму,
поскольку эта ПЦР носит вспомогательный характер, а именно она помогает
определить, содержит ли анализируемый образец бактериальную ДНК, качество
которой позволяет амплификацию в ПЦР.
В качестве генетических маркеров
для выявления ДНК бактерий были выбраны фрагменты:
− для Esherichia coli – фрагмент
хромосомного гена сsrB малой некодирующей РНК, которая в комплексе с белком CsrA
образует рибопротеин, регулирующий синтез гликогена;
− для Salmonella enterica –
фрагмент хромосомного гена invA, продукт которого необходим для инвазии
бактерий через эпителиальные клетки кишечника.
− для рода Enterococcus и для
рода Campylobacter – фрагменты генов 23S рРНК рибосомной РНК.
Ввиду достаточного полиморфизма
среди генов резистентности одной группы дизайн праймеров осуществлялся с учетом
максимального охвата количества генов в кластере и детекции наиболее часто встречаемых
вариантов в образцах ветеринарного происхождения.
Валидацию методик проводили на
соответствие критериям принятия решения, предъявляемым к ПЦР-методикам.
Специфичность ПЦР оценивали на контрольной панели, содержащей ДНК из чистых
бактериальных культур коллекции ФГБУ «ВГНКИ». В качестве положительных и отрицательных
контролей использовали референтные образцы, охарактеризованные полногеномно, с
указанием на присутствие или отсутствие генов резистентности к различным
антибиотикам.
Аналитическую чувствительность и
эффективность ПЦР оценивали с использованием разведений плазмидных ДНК,
содержащих клонированные фрагменты целевых генов, и геномной ДНК референтных
образцов. В рамках предложенной панели все системы детекции генов резистентности
показали 100 % специфичность, наблюдалась амплификация только целевых фрагментов.
Аналитическая чувствительность ПЦР составила от 5*103 до 2*104 копий/мл,
эффективность ПЦР более 90 %, что соответствует критериям, предъявляемым к
ПЦР-методикам.
С использованием разработанных
методик было проанализировано на наличие генов резистентности более 350
образцов из объектов окружающей среды без этапа выделения бактериальных
изолятов. Образцы представляли собой смывы с клеток, стен, оборудования;
образцы фекалий, подстилку, почву, корм и др. Пробы были отобраны на
животноводческих и птицеводческих комплексах, в фермерских хозяйствах в разных
регионах РФ.
Гены резистентности к
тетрациклинам, пенициллинам и цефалоспоринам наиболее часто выявляли на
птицефабриках, в свинокомплексах и коровниках, гены резистентности к
фторхинолонам и колистину – на птицефабриках и в свинокомплексах. Обнаружения
генов резистентности были более характерны для бактерий, собранных в местах
скученного содержания птиц, стойлового содержании коров и свиней по сравнению
со свободным выпасом. В значительном числе образцов были выявлены гены
устойчивости к стрептомицину, спектиномицину, сульфадиазину, сульфаметоксазолу.
Разработанные ПЦР-методики
позволяют проводить экспрессвыявление генов резистентности в пробах из
окружающей среды, продовольственного сырья или в биоматериале от животных, в
том числе и без предварительного изолирования чистых культур микроорганизмов. В
настоящее время данные разработки применяются в рамках комплексного
ветеринарного мониторинга резистентности бактерий к антимикробным средствам
ветеринарного применения. Данный мониторинг является важной частью надзора за
безопасностью пищевой цепи.
|
