Резистентность патогенных микроорганизмов к антимикробным средствам – одна из наиболее серьёзных угроз мирового здравоохранения. Для борьбы с этой угрозой всемирными организациями ВОЗ, ВОЗЖ и ФАО принят подход «Единое здоровье», согласно которому необходим контроль распространения устойчивости к антибиотикам не только среди возбудителей инфекционных заболеваний человека, но также среди бактерий, вызывающих зоонозные инфекции. Данная работа посвящена разработке ПЦР-методик для выявления наиболее часто встречающихся у зоонозных бактерий генов устойчивости, в том числе к критически важным для медицины антибиотикам: цефалоспоринам, колистину, фторхинолонам, а также к пенициллинам, тетрациклинам, амногликозидам, сульфаниламидам и триметоприму. Использование разработанных методик возможно в рамках ветеринарного мониторинга антибиотикорезистентности для анализа различных образцов, в том числе и без предварительного выделения бактериальных изолятов.

Резистентность возбудителей инфекционных заболеваний к антибиотикам является глобальной проблемой как клинической, так и ветеринарной медицины. В процессе распространения антибиотикорезистентности в окружающей среде играет важную роль общая совокупность в ней патогенных, комменсальных и свободно живущих бактерий, бактериофагов и мобильных генетических элементов, которая является резервуаром резистентности, так называемым «резистомом».

Генетические факторы антибиотикорезистентности бактерий, как правило, ассоциированы с мобильной частью бактериального генома: плазмидами, транспозонами, интегронами, геномными островками и др. Это приводит к возможности горизонтального переноса генов резистентности между таксономически отдаленными микроорганизмами. Именно так патогенные микроорганизмы могут получить гены устойчивости к антибиотикам из резистома.

Координация усилий медицинских и сельскохозяйственных контролирующих организаций является одним из ключевых пунктов рекомендаций Всемирной организации здоровья животных (ВОЗЖ) и ВОЗ по разработке национальных планов противодействия распространению антибиотикорезистентности. Важным направлением как в клинической практике, так и в ветеринарии стал системный мониторинг распространения антимикробной резистентности бактерий, в т.ч. с помощью современных молекулярно-генетических методов. Для ветеринарного мониторинга назрела необходимость разработки экспресс-методик выявления генов антибиотикорезистентности, наиболее часто встречающихся у бактерий ветеринарного происхождения, поскольку существующие на рынке отечественные тест-системы ориентированы на клинический материал, а не на материал от животных.

Для выбора и анализа последовательностей генов резистентности и внутреннего контроля были использованы базы данных NCBI BARRGD, Arg-ANNOT, CARD и ResFinder, а также собственные данные. Подбор праймеров и зондов производили на онлайн-ресурсе «PrimerQuest Tool» (IDT) [8], анализировали не менее пяти набороволигонуклеотидов для выявления каждого целевого гена. Для анализа множественного выравнивания последовательностей использовали программу Ugene и алгоритм Clustal omega. Для выбора оптимальных параметров структурных характеристик наборов праймеров использовали программы PCR Primer Stats и Oligo Analysis Tool, оценивали оптимальную температуру отжига, возможность образования димеров и «шпилек». Специфичность праймеров оценивали при помощи онлайн-ресурса «Primer-Blast», расположенного на сайте NCBI. Оптимизированы условия мультиплексных ПЦР для амплификации фрагментов целевых генов. Выделение ДНК проводили сорбционным методом с использованием коммерческих наборов реагентов.

В ФГБУ «ВГНКИ» на текущий момент разработаны молекулярно-генетические методики выявления наиболее часто встречающихся генов резистентности, в том числе к критически важным для медицины антибиотикам: цефалоспоринам (CTX-M-1, CTX-M-9), колистину (mcr-1), к фторхинолонам (qnrS, qnrB), а также к пенициллинам (CMY), тетрациклинам (tetA, tetM, tetO), амногликозидам (aadA), сульфаниламидам (sul1) и триметоприму (dfrA12).

Сущность методик заключается в применении ПЦР в режиме реального времени с использованием TaqMan-подобных зондов для детекции фрагментов целевых генов в мультиплексном формате. Методики распространяются на пробы, полученные от животных (фекалии и др.), из объектов окружающей среды (смывы с клеток, стен, оборудования, подстилка и др.), из продовольственного сырья, пищевых продуктов, без этапа выделения бактериальных изолятов, а также чистые бактериальные культуры, выделенные из этих проб.

Выбор генов-мишеней проводился на основе анализа литературных данных о встречаемости генов в бактериях ветеринарного и медицинского происхождения и базы данных Pathogen Detection NCBI, результатов ветеринарного мониторинга антибиотикорезистености в РФ, в том числе данных полногеномного секвенирования выделенных изолятов. Кроме того, при выборе учитывалась локализация генов в составе мобильных генетических элементов.

По результатам проведенного анализа в качестве мишеней были выбраны гены, наиболее часто встречающиеся в образцах от животных, из окружающей среды животноводческих и птицеводческих комплексов, продуктах питания:

− гены плазмидных β-лактамаз расширенного спектра класса А из субкластеров СТХ-М-1 и СТХ-М-9, гидролизующих цефалоспорины и обеспечивающих инактивацию антибиотиков;

− гены β-лактамаз класса С CMY, гидролизующих пенициллины и обеспечивающих инактивацию антибиотиков;

− плазмидный ген mcr-1, который кодирует фермент, модифицирующий липид А наружной мембраны грамотрицательных бактерий, снижающий связывание колистина с клеточной стенкой;

− плазмид-ассоциированные гены qnrS и qnrB, которые кодируют белки, связывающиеся с ДНК-гиразой или топоизомеразой IV и препятствующие взаимодействию фторхинолонов с данным ферментом;

− гены tetM и tetO, кодирующие белки, нарушающие связывание тетрациклинов с 23S рибосомальной РНК бактерий;

− ген tetA, который кодирует трансмембраннный белок, осуществляющий выведение тетрациклинов из клетки путем активного транспорта;

− генов группы aadA, кодирующих О-аденилтрансферазы, модифицирующие аминогликозиды путем присоединения нуклеотида аденина;

− гены sul1 и dfrA12, кодирущие атипичные ферменты пути биосинтеза фолатов дигидроптероатсинтетазу и дигидрофолатредуктазу, соответственно, практически не чувствительные к сульфаниламидам и триметоприму.

В разрабатываемых методиках выявления генов резистентности в качестве дополнительного внутреннего контроля предусматривается выявление ДНК бактерий E. coli, Salmonella enterica, родов Enterococcus, Campylobacter, часто представленных в смешанных метагеномных образцах ДНК. Кроме того, данные микроорганизмы входит в состав обязательной панели ветеринарного мониторинга антибиотикорезистентности. Выявление этих бактерий поможет сравнивать данные, полученные микробиологическими и молекулярно-биологическими методами. Система детекции для внутреннего контроля не должна быть строго специфичной по отношению к указанному микроорганизму, поскольку эта ПЦР носит вспомогательный характер, а именно она помогает определить, содержит ли анализируемый образец бактериальную ДНК, качество которой позволяет амплификацию в ПЦР.

В качестве генетических маркеров для выявления ДНК бактерий были выбраны фрагменты:

− для Esherichia coli – фрагмент хромосомного гена сsrB малой некодирующей РНК, которая в комплексе с белком CsrA образует рибопротеин, регулирующий синтез гликогена;

− для Salmonella enterica – фрагмент хромосомного гена invA, продукт которого необходим для инвазии бактерий через эпителиальные клетки кишечника.

− для рода Enterococcus и для рода Campylobacter – фрагменты генов 23S рРНК рибосомной РНК.

Ввиду достаточного полиморфизма среди генов резистентности одной группы дизайн праймеров осуществлялся с учетом максимального охвата количества генов в кластере и детекции наиболее часто встречаемых вариантов в образцах ветеринарного происхождения.

Валидацию методик проводили на соответствие критериям принятия решения, предъявляемым к ПЦР-методикам. Специфичность ПЦР оценивали на контрольной панели, содержащей ДНК из чистых бактериальных культур коллекции ФГБУ «ВГНКИ». В качестве положительных и отрицательных контролей использовали референтные образцы, охарактеризованные полногеномно, с указанием на присутствие или отсутствие генов резистентности к различным антибиотикам.

Аналитическую чувствительность и эффективность ПЦР оценивали с использованием разведений плазмидных ДНК, содержащих клонированные фрагменты целевых генов, и геномной ДНК референтных образцов. В рамках предложенной панели все системы детекции генов резистентности показали 100 % специфичность, наблюдалась амплификация только целевых фрагментов. Аналитическая чувствительность ПЦР составила от 5*103 до 2*104 копий/мл, эффективность ПЦР более 90 %, что соответствует критериям, предъявляемым к ПЦР-методикам.

С использованием разработанных методик было проанализировано на наличие генов резистентности более 350 образцов из объектов окружающей среды без этапа выделения бактериальных изолятов. Образцы представляли собой смывы с клеток, стен, оборудования; образцы фекалий, подстилку, почву, корм и др. Пробы были отобраны на животноводческих и птицеводческих комплексах, в фермерских хозяйствах в разных регионах РФ.

Гены резистентности к тетрациклинам, пенициллинам и цефалоспоринам наиболее часто выявляли на птицефабриках, в свинокомплексах и коровниках, гены резистентности к фторхинолонам и колистину – на птицефабриках и в свинокомплексах. Обнаружения генов резистентности были более характерны для бактерий, собранных в местах скученного содержания птиц, стойлового содержании коров и свиней по сравнению со свободным выпасом. В значительном числе образцов были выявлены гены устойчивости к стрептомицину, спектиномицину, сульфадиазину, сульфаметоксазолу.

Разработанные ПЦР-методики позволяют проводить экспрессвыявление генов резистентности в пробах из окружающей среды, продовольственного сырья или в биоматериале от животных, в том числе и без предварительного изолирования чистых культур микроорганизмов. В настоящее время данные разработки применяются в рамках комплексного ветеринарного мониторинга резистентности бактерий к антимикробным средствам ветеринарного применения. Данный мониторинг является важной частью надзора за безопасностью пищевой цепи.