|
В целях мониторинга кормовых
добавок и лекарственных средств для животных на наличие в них генетически
модифицированных микроорганизмов была необходима разработка и валидация
доступных и недорогих скрининговых методик выявления ГМ штаммов бактерий.
Основным вариантом для разработки был выбран поиск маркерных генов
резистентности, входящих в состав экспрессирующих векторов. Разработанные
методики основаны на применении мультиплексной ПЦР в режиме реального времени
для выявления фрагментов генов устойчивости к блеомицину (ble), аминоглиозидам
(aadD) и хлорамфениколу (cat) совместно с внутренним контролем. В качестве
внутреннего контроля предусмотрено выявление ДНК бактерий рода Bacillus. В
отдельной пробирке детектируется экзогенный синтетический внутренний
контрольный образец с целью подтверждения наличия в образце ДНК, качество
которой приемлемо для получения ПЦР-продукта. Валидационные испытания показали
соответствие критериям принятия решения, предъявляемым к ПЦР-методикам.
Генетически модифицированные
микроорганизмы (ГММ) используют в индустриальном производстве компонентов
кормов и пищевых продуктов: незаменимых аминокислот, пищевых и кормовых
ферментов, витаминов, пищевых добавок, усилителей вкуса, веганских альтернатив
мясным и молочным продуктам и др. При этом не допускается присутствие ГММ в
составе готового продукта микробиологического синтеза.
Кроме того, генетически
модифицированные (ГМ) бактерии используются в качестве пробиотических
препаратов как для животных, так и для человека. В настоящее время существует
большое количество препаратов на основе бактерий рода Bacillus, которые
являются одними из наиболее перспективных для создания рекомбинантных
пробиотиков благодаря высокой антагонистической активности и удобству
клонирования в них чужеродных генов про- и эукариотического происхождения.
Бактерии рода Bacillus не образуют биопленок на слизистых оболочках организма
хозяина, вследствие чего не способны бесконтрольно персестировать в его
организме.
В Европейском союзе ввиду
широкого применения ГМ штаммов-продуцентов продукция микробиологического
синтеза подвергается проверкам во стороны контролирующих органов. Так, в
Европейской системе оповещения о нарушениях в области контроля пищевых
продуктов и кормов RASSF Portal публикуются обнаружения неавторизованных ГММ в
пищевых и кормовых добавках.
В последние годы увеличилось
количество случаев выявления ГМ бактерий в кормовых добавках, сырье для которых
чаще всего поступало из Китая. Впервые живой штамм Bacillus subtilis, способный
повышать выработку рибофлавина, был обнаружен в кормовой добавке в 2014 году
[6]. Повторные находки ГМ бактерий в 2018 г. и позднее поставили вопрос о
необходимости создании алгоритма исследования на наличие генетически
модифицированных микроорганизмов. Для подтверждения модификации бактерий в ЕС
использовался дорогостоящий и трудоемкий метод полногеномного секвенирования.
Для рутинных скрининговых исследований целесообразно использовать простые и
дешевые молекулярно-генетические методики на основе ПЦР.
Поскольку для создания ГММ
используют ряд молекулярно-генетических инструментальных последовательностей,
таких как клонирующие векторы, промоторы для экспрессии генов, маркерные гены
для селекции рекомбинантных микроорганизмов, то, соответственно, для скрининга
на присутствие в образце ДНК ГММ можно использовать детекцию стандартных
элементов этих молекулярногенетических инструментов.
Зарубежными авторами предложено
несколько методик, успешно испытанных на ГМ штаммах бактерий. Как правило,
мишенями для ПЦР выбирались фрагменты часто используемых генов устойчивости к
антибиотикам, а также фрагменты генно-инженерных конструкций.
Для тестирования пищевой
продукции, сырья, пищевых и биологически активных добавок к пище, полученных с
использованием ГММ, в России были утверждены МУК 4.2.2305-07. Однако в то же
время не существовало скрининговых методик для исследования кормовых добавок и
лекарственных средств для животных и необходима была их разработка и внедрение
в практику.
Таким образом, целью нашей работы
стала разработка и валидация методик выявления генетически модифицированных
штаммов бактерий, используемых при производстве кормовых добавок и
лекарственных средств для животных.
Для поиска ДНК
последовательностей использовали базы данных NCBI, ENA, EMBL, DDBJ. Поиск
гомологичных последовательностей проводили с помощью BLAST, множественное
выравнивание осуществляли при помощи программы Ugene и алгоритма Clustal omega.
Для выбора праймеров и оценки их
качества использовали ресурсы PrimerQuest Tool (IDT), OligoAnalyzer (IDT), PCR
Primer Stats, Eurofinsgenomics Oligo Analysis Tool и PCR Primer Design.
Специфичность праймеров оценивали при помощи онлайнресурса NCBI Primer-Blast.
Для практического исследования методик на
специфичность готовили контрольную панель, содержащую ДНК, выделенную из
различных чистых бактериальных культур. В качестве контрольных использовали ДНК
изолятов, которые охарактеризованы полногеномно, с указанием на присутствие или
отсутствие какого-либо из таргетных генов: cat, aadD, ble, а также отсутствие
или присутствие других генов устойчивости к хлорамфениколу, аминогликозидам,
блеомицину. Также были использованы штаммы различных видов бактерий рода
Bacillus из «Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов,
используемых в ветеринарии и животноводстве» ФГБУ «ВГНКИ», и ДНК штаммов из
исследовательской коллекции ФГБУ «ВГНКИ».
Выделение ДНК в присутствии
экзогенного ВКО осуществляли сорбционным методом с помощью набора реагентов
«ДНК-сорб-В» (ФБУН ЦНИИЭ, Россия). Качество и количество выделенной ДНК
оценивали на спектрофотометре Nanodrop 2000 (Thermo Scientific, США). ПЦР в
режиме реального времени проводили на приборах Rotor-Gene Q (Qiagen, Германия)
и CFX96 C1000 Touch (Bio-Rad Laboratories, США).
В ходе работы нами была изучена
генетическая структура часто используемых ГМ бактерий и рассмотрены различные
подходы к выбору элементов-мишеней для скрининговых методик. Основным вариантом
для разработки был выбран поиск фрагментов генов резистентности, входящих в
состав экспрессирующих векторов и используемых в качестве маркерных для
селекции ГММ.
В качестве мишеней нами были
выбраны три достаточно широко используемых в ГМ штаммах-продуцентах маркерных
гена резистентности к антибиотикам: ген устойчивости к блеомицину ble, ген
устойчивости к хлорамфениколу cat и ген устойчивости к аминогликозидам aadD.
Дизайн олигонуклеотидов для
выявления целевых фрагментов проводили таким образом, чтобы длины ожидаемых
ПЦР-продуктов были максимально возможными (220-250 п.н.). Поскольку все
ферменты для молекулярной биологии являются рекомбинантными, есть риск
контаминации лабораторных реагентов остаточной ДНК бактерий-продуцентов и,
соответственно, риск ложноположительных результатов. Однако такая остаточная
ДНК должна быть сильно фрагментирована, поэтому использование длинных
фрагментов исключит проблему.
Согласно анализу патентов в базе
данных European Food Safety Authority (EFSA), большинство штаммов-продуцентов,
которые используются в пищевой и кормовой промышленности, принадлежит к видам
Bacillus licheniformis и Bacillus subtilis (более 75%).
В качестве мишени для выявления
последовательности внутреннего контроля, показывающей присутствие в образце ДНК
B. subtilis и B. licheniformis, выбрали консервативный ген домашнего хозяйства
rplM, который кодирует белок M большой субъединицы рибосомы.
При выборе олигонуклеотидов для
внутреннего контроля пользовались общими принципами. В связи с тем, что
планировалась разработка мультиплексных систем, получаемый ампликон фрагмента
внутреннего контроля должен быть похож на ампликоны целевых фрагментов по длине
и GC-составу. ПЦР для внутреннего контроля должна обладать требуемой
специфичностью и не давать флуоресцентного сигнала при наличии в пробе ДНК
нецелевых бактерий.
Биоинформатическую проверку
специфичности проводили путем множественного выравнивания области отжига
праймеров и зонда на последовательности гена rplM бактерий рода Bacillus, а
также других бактерий, которые могут являться продуцентами при
микробиологическом синтезе или входить в состав пробиотиков. Набор
олигонуклеотидов для внутреннего контроля помимо B. subtilis и B. licheniformis
способен выявлять присутствие ДНК B. amyloliquefaciens, B. inaquosorum, B.
stercoris, B halotolerans, B. haynesii, B paralicheniformis, B. mojavensis, B.
cabrialesii, B. tequilensis, B. swezeyi, B. atrophaeus subsp. globigii, B.
rugosus, B. vallismortis, B. nakamurai, B. siamensis, B. velezensis.
Фрагмент соответствующего
целевого гена и ДНК Bacillus детектируются в одной пробирке в двух независимых
ПЦР с использованием специфичных праймеров и зондов, меченых разными
флуоресцентными красителями. В отдельной пробирке детектируется экзогенный
синтетический внутренний контрольный образец (ВКО).
В качестве экзогенного ВКО
использовали ранее разработанную конструкцию, представляющую собой искусственно
синтезированный участок ДНК, клонированный в ДНК фага лямбда. Такой внутренний
контроль этапа выделения необходим для подтверждения наличия в образце ДНК,
качество которой приемлемо для получения ПЦР-продуктов. Детекция экзогенного
ВКО проводится с использованием отдельного набора олигонуклеотидов,
разработанного ранее.
В рамках оптимизации условий были
проведены эксперименты по выделению ДНК из образцов в присутствии ВКО. В серии
экспериментов с использованием растворов плазмидной ДНК, содержащей
соответствующие клонированные целевые фрагменты, и геномной ДНК подобраны
оптимальные концентрации олигонуклеотидов и параметры температурного
циклирования для каждого из термоциклеров.
Валидацию разработанных систем
проводили на соответствие критериям принятия решения, предъявляемым к
ПЦР-методикам.
Для подтверждения специфичности
методик использовали контрольную панель образцов ДНК, а также искусственно
синтезированные конструкции, содержащие целевые фрагменты генов ble, cat, aadD.
При использовании двух моделей термоциклеров (RotorGene Q и CFX96 C1000 Touch)
получены аналогичные результаты. В рамках предложенной панели мультиплексные
системы детекции показали 100 % специфичность.
Для определения аналитической
чувствительности и эффективности ПЦР использовали растворы плазмидной ДНК c
известной концентрацией, содержащие соответствующие клонированные целевые
фрагменты генов ble, cat, aadD и фрагмент ДНК Bacillus и геномной ДНК,
выделенной из чистых культур бактерий контрольной панели. Тестирование
проводили на обеих моделях термоциклеров. С целью достоверного установления
порога чувствительности методик дополнительно проводили определение
вариабельности результатов определения количества копий целевой ДНК на пределе
чувствительности. Для этого проводили расчет относительного стандартного
отклонения RSD, в качестве предела чувствительности выбирали то количество
копий, при которой RSD не превышает 25 %.
Аналитическая чувствительность методик
составила от 7*103 до 1,5*104 копий/мл, эффективность ПЦР – более 90 %, что
соответствует критериям, предъявляемым к ПЦР-методикам.
Разработанные ПЦР-методики
предназначены для выявления фрагментов генов резистентности ble, cat и aadD,
используемых в генно-инженерных векторах для модификации бактерий, совместно с
выявлением ДНК бактерий рода Bacillus в качестве внутреннего контроля. В
отдельной пробирке детектируется экзогенный ВКО для подтверждения наличия в
образце ДНК приемлемого качества.
Методики будут использоваться для
тестирования кормовых добавок, лекарственных средств для животных, полученных
путем микробиологического синтеза (пробиотики, аминокислоты, витамины, ферменты
и пр.) и образцов бактериальных культур в рамках мониторинга ГМО.
|
